PROCEDIMENTO :
L'esame si basa sulla colorazione delle cellule in coltura con un colorante basico (per esempio violetto di genziana o violetto di nicolle fatto reagire per 3 min.) e lavaggio con liquido di Lugol, un mordenzante (sostanza che favorisce la penetrazione del colore nella struttura che deve essere colorata) che si lascia agire per circa 1 minuto. Successivamente il materiale organico viene lavato con una soluzione decolorante (alcool etilico o simili) e infine con acqua. A questo punto i batteri gram + hanno trattenuto il colorante basico,hanno trattenuto il viola, mentre i gram - sono grigiastri, privi di colorazione, questo perché l'alcool ha sciolto i lipidi dei gram negativi. Per far risaltare meglio la differenza si colora quindi il materiale con un colorante di contrasto, in genere safranina o fucsina (o eosina). La Safranina colora le cellule in rosso e l'Eosina in rosa. Queste sostanze possono penetrare solo in cellule decolorate. Dopo questo passo finale, i batteri gram+ hanno colore violetto, mentre i gram- hanno color rosso o rosa o alcune volte giallastro.
Le colture batteriche molto vecchie tendono a trattenere meno il colorante, apparendo meno gram-positive di quanto siano in realtà; alcune (poche) specie di batteri inoltre non danno un responso chiaro alla colorazione, e sono dette gram-variabili.
La colorazione di Gram è una colorazione di tipo regressivo in quanto dopo una prima colorazione generale con violetto di nicole o di genziana, avverrà una decolorazione dei batteri gram- con dell' alcool etilico puro, per poi essere ricolorati utilizzando della safranina.
Bacillus cereus GRAM+
Eshericchia coli GRAM-
