Materiale

• 1g di Acetil-D/L-Phenilalanina(AC-D/L-Phe-OH)
• acilasi 1 da rene di maiale
• soluzione di NaOH 1M
• tampone fosfato(ottenuto sciogliendo 0,03g di CoCl2 e 6,8g di KH2PO4 o NaH2PO4  in un matraccio da 500mL e aggiungendo 4 mL di NaOH 1M)
• soluzione 1M di HCl
• anidride acetica

Procedimento

• RISOLUZIONE DELL'Ac-D/L-Phe-OH: un campione di acilasi (10 mg, bilancia analitica!!) viene posto in un pallone da 100 mL e sciolto con 40 mL di tampone fosfato. In una provetta sciogliere 1g di AC-D/L-Phe-OH con 5 mL di NaOH (puo essere necessario scaldare), aggiungere la soluzione ottenuta a quella dell'enzima. Mettere il pallone in bagno termostatato a 37°C per almeno 2 ore (meglio fino al giorno dopo). Seguire il progredire della reazione con TLC(scansione) usando come eluente Butanolo/acqua/acido acetico (60:15:25).(Può essere utile la preparazione di un TLC standard come in foto in cui si depositano L-Phe-Oh, Ac-D-Phe-OH, Ac-DL-Phe-OH e un racemo di Ac-D-Phe-OH e L-Phe-OH).
• SEPARAZIONE  DI Ac-D-Phe-OH e L-Phe-OH: raffreddare la miscela di reazione ottenuta in bagno di ghiaccio e acidificare a ph2 con HCl 1M. trasferire la soluzione in un imbuto separatore ed estrarre con 40 mL di acetato di etile (ATTENZIONE: per evitare emulsioni non sbattere energicamente le 2 fasi ma tenerle in rotazione. Se le 2 fasi non si separano aggiungere mezza spatola di NaCl). raccogliere in 2 beute le fasi separate. Trasferire la fase acquosa nell'imbuto separatore ed estrarre nuovamente con altri 40 mL di acetato di etile. Raccogliere la fase acquosa in una beuta e unire le 2 fasi organiche in un'altra.

        Nelle due beute si avranno:

        1- Acetato di etile con Ac-D-Phe-OH (e un po' di Ac-L-Phe-OH se la reazione con l'acilasi non si è compiuta).

        2-Soluzione acquosa contenente L-Phe-OH a pH 2

        Verificare via TLC il contenuto delle 2 beute.

• ISOLAMENTO Ac-D-Phe-OH: anidrificare la fase organica (1) con Na2SO4 anidro. Dopo 15-20 minuti filtrare in un pallone tarato. Evaporare il solvente (Acetato di etile) all'evaporatore rotante, pesare il pallone e annotare la quantità di prodotto ottenuto.
• ACETILAZIONE DELLA L-Phe-OH ED ISOLAMENTO DELL'Ac-L-Phe-OH: la soluzione acquosa acida di L-Phe-OH viene raffreddata in bagno di ghiaccio e portata a pH9 con NaOH 1M. Sempre in bagno di ghiaccio e sotto agitazione, aggiungere 2 mL di anidride acetica. Allontanare il bagno di acqua ghiaccio e lasciare la reazione sotto agitazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Seguire la formazione del prodotto acetilato via TLC. Raffreddare la miscela e portarla a pH2 con HCl 1M. Trasferire la miscela in un imbuto separatore e fare 2 lavaggi con Acetato di etile. Separare le 2 fasi e anidrificare la fase organica con Na2SO4 , filtrare dopo 20 minuti in un pallone tarato ed eliminare il solvente( acetato di etile) all'evaporatore rotante . Pesare il pallone e annotare la quantità di prodotto ottenuto.

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